Realització de quatre assaigs d'amplificació d'àcids nucleics per identificar el SARS-CoV-2 a Etiòpia

Gràcies per visitar Nature.com. Esteu utilitzant una versió del navegador amb compatibilitat limitada amb CSS. Per a una millor experiència, us recomanem que utilitzeu un navegador actualitzat (o que desactiveu el mode de compatibilitat a l'Internet Explorer). A més, per garantir una assistència contínua, mostrem el lloc web sense estils ni JavaScript.
Mostra un carrusel de tres diapositives alhora. Feu servir els botons Anterior i Següent per moure's per tres diapositives alhora o feu servir els botons lliscants del final per moure's per tres diapositives alhora.
Des del brot de la malaltia per coronavirus (COVID-19) del 2019, s'han desenvolupat moltes proves d'amplificació d'àcids nucleics (NAAT) comercials arreu del món i s'han convertit en assaigs estàndard. Tot i que es van desenvolupar ràpidament diverses proves i es van aplicar a proves de diagnòstic de laboratori, el rendiment d'aquestes proves no s'ha avaluat en diversos entorns. Per tant, aquest estudi tenia com a objectiu avaluar el rendiment dels assaigs Abbott SARS-CoV-2, Daan Gene, BGI i Sansure Biotech utilitzant l'estàndard de referència compost (CRS). L'estudi es va dur a terme a l'Institut de Salut Pública d'Etiòpia (EPHI) de l'1 al 30 de desembre de 2020. Es van extreure 164 mostres nasofaríngies utilitzant el kit QIAamp RNA mini i el sistema de preparació de mostres d'ADN Abbott. De les 164 mostres, el 59,1% van ser positives i el 40,9% van ser negatives per a CRS. La positivitat de Sansure Biotech va ser significativament baixa en comparació amb la CRS (p < 0,05). La positivitat de Sansure Biotech va ser significativament baixa en comparació amb la CRS (p < 0,05). Положительные результаты Sansure Biotech были значительно ниже по сравнению с CRS (p < 0,05). Els resultats positius de Sansure Biotech van ser significativament més baixos en comparació amb CRS (p < 0,05).与CRS 相比，Sansure Biotech 的阳性率显着较低（p <0,05）。与CRS 相比，Sansure Biotech 的阳性率显着较低（p <0,05）。 У Sansure Biotech было значительно меньше положительных результатов по сравнению с CRS (p < 0,05). Sansure Biotech va tenir significativament menys resultats positius en comparació amb CRS (p < 0,05).La concordança global de les quatre anàlisis va ser del 96,3–100% en comparació amb CRS. A més de la baixa taxa de positivitat de l'assaig Sansure Biotech, el rendiment dels quatre assaigs va ser gairebé comparable. Per tant, l'assaig Sansure Biotech [Només per a recerca (RUO)] requereix una validació addicional per al seu ús a Etiòpia. Finalment, s'hauria de considerar la possibilitat de fer més recerca per avaluar els assaigs amb les afirmacions adequades del fabricant.
Les proves de laboratori formen part del Pla estratègic de preparació i resposta a la malaltia per coronavirus 2019 (COVID-19) de l'Organització Mundial de la Salut (OMS). L'OMS aconsella que els països han de desenvolupar la capacitat dels laboratoris per millorar la preparació, la gestió adequada dels casos, la vigilància i la resposta ràpida als reptes de salut pública. Això suggereix que el paper del laboratori és clau per caracteritzar la malaltia i l'epidemiologia dels agents infecciosos emergents i controlar la seva propagació.
El diagnòstic de la COVID-19 requereix informació epidemiològica i mèdica, símptomes/signes personals i dades radiogràfiques i de laboratori2. Des que es va informar del brot de COVID-19 a Wuhan, Xina, s'han desenvolupat moltes proves comercials d'amplificació d'àcids nucleics (NAAT) arreu del món. La reacció en cadena de la polimerasa amb transcripció inversa en temps real (rRT-PCR) s'ha utilitzat com a mètode rutinari i estàndard per al diagnòstic de laboratori de la infecció per la síndrome respiratòria aguda greu 2 (SARS-CoV-2)3. La detecció molecular del SARS-CoV-2 es basa normalment en els gens N (gen de la proteïna de la nucleocàpsida), E (gen de la proteïna de l'embolcall) i RdRp (gen de l'ARN polimerasa dependent d'ARN) a la regió ORF1a/b (gen del marc de lectura obert 1a/b) identificada a partir del genoma viral. Es consideren les principals regions conservades que es troben en els genomes virals per al reconeixement de virus4. Entre aquests gens, els gens RdRp i E tenen una alta sensibilitat de detecció analítica, mentre que el gen N té una baixa sensibilitat analítica5.
El rendiment dels assaigs de PCR pot variar en funció de diversos factors, com ara: reactius d'extracció, reactius d'amplificació/detecció, mètode d'extracció, qualitat de la màquina de PCR i altres instruments. A l'abril de 2020, més de 48 dispositius de diagnòstic diferents de nou països han rebut l'autorització d'ús d'emergència (EUA) per al diagnòstic de la COVID-196. A Etiòpia, s'utilitzen més de 14 plataformes de PCR en temps real per a la detecció per PCR del SARS-CoV-2 en 26 institucions de salut pública, incloent-hi ABI 7500, Abbott m2000, Roche 48000 i Quant-studio7. A més, hi ha diversos kits de proves de PCR disponibles, com ara la prova de Daan Gene, la prova d'Abbott SARS-CoV-2, la prova de Sansure Biotech i la prova BGI del SARS-CoV-2. Tot i que la rRT-PCR és altament sensible, alguns pacients amb COVID-19 informen de resultats falsos negatius a causa de còpies insuficients d'àcid ribonucleic (ARN) viral en mostres a causa d'una recollida, transport, emmagatzematge i manipulació inadequats, i proves de laboratori. condicions i accions del personal8. A més, la mala manipulació de mostres o controls, l'establiment del llindar del cicle (Ct) i la reactivitat creuada amb altres àcids nucleics patògens o ARN inactiu/residual del SARS-CoV-2 poden conduir a resultats falsos positius en els assaigs de rRT-PCR9. Per tant, és clar que les proves PCR poden identificar portadors de fragments de gens, ja que ni tan sols poden distingir entre gens virals realment actius, de manera que les proves només poden identificar portadors i no pacients10. Per tant, és important avaluar el rendiment diagnòstic mitjançant mètodes estàndard en el nostre entorn. Tot i que hi ha molts reactius NAAT disponibles a l'Institut de Salut Pública d'Etiòpia (EPHI) i a tot el país, encara no s'ha publicat cap avaluació comparativa de la seva eficàcia. Per tant, aquest estudi tenia com a objectiu avaluar el rendiment comparatiu dels kits disponibles comercialment per a la detecció del SARS-CoV-2 mitjançant rRT-PCR utilitzant mostres clíniques.
En aquest estudi es van incloure un total de 164 participants amb sospita de COVID-19. La majoria de les mostres provenien de centres de tractament (118/164 = 72%), mentre que els 46 participants restants (28%) provenien de centres no tractats. Entre els participants no tractats al centre, 15 (9,1%) tenien casos clínicament sospitosos i 31 (18,9%) tenien contactes de casos confirmats. Noranta-tres (56,7%) participants eren homes, i l'edat mitjana (± DE) dels participants era de 31,10 (± 11,82) anys.
En aquest estudi, es van determinar les taxes positives i negatives de quatre proves per a la COVID-19. Així, les taxes positives de l'assaig Abbott SARS-CoV-2, l'assaig Daan Gene 2019-nCoV, l'assaig SARS-CoV-2 BGI i l'assaig Sansure Biotech 2019-nCoV van ser del 59,1%, 58,5%, 57,9% i 55,5% respectivament. Les puntuacions positives i negatives de l'estàndard de referència compost (CRS) van ser de 97 (59,1%) i 67 (40,9%), respectivament (Taula 1). En aquest estudi, la definició de CRS es va basar en la regla de "qualsevol positiu", segons la qual, de quatre resultats de proves, dos o més resultats de proves que van donar el mateix resultat es van considerar veritables positius o negatius.
En aquest estudi, vam trobar un percentatge de concordança negativa (NPA) del 100% (IC del 95% 94,6–100) per a totes les anàlisis en comparació amb CRS. L'anàlisi de Sansure Biotechnology va mostrar un PPA mínim del 93,8% (IC del 95% 87,2-97,1) i l'anàlisi del Daan Gene 2019-nCoV va tenir una concordança global del 99,4% (IC del 95% 96,6-99,9). En canvi, la concordança global entre l'assaig SARS-CoV-2 BGI i l'assaig Sansure Biotech 2019-nCoV va ser del 98,8% i el 96,3%, respectivament (Taula 2).
El coeficient de concordança kappa de Cohen entre els resultats de l'assaig CRS i Abbott SARS-CoV-2 va ser totalment consistent (K = 1,00). De la mateixa manera, els valors kappa de Cohen detectats per Daan Gene 2019-nCoV, SARS-CoV-2 BGI i Sansure Biotech 2019-nCoV també són totalment consistents amb CRS (K ≥ 0,925). En aquesta anàlisi comparativa, la prova de khi quadrat (prova de McNemar) va mostrar que els resultats de l'assaig Sansure Biotech 2019-nCoV eren significativament diferents dels resultats de CRS (p = 0,031) (Taula 2).
Com es mostra a la figura.1 el percentatge del valor Ct més baix (< 20 Ct) de l'assaig Abbott SARS-CoV-2 (gen combinat RdRp i N) va ser del 87,6% i el valor Ct del gen ORF1a/b de l'assaig Sansure Biotech 2019-nCoV va mostrar que el percentatge de valor Ct baix (< 20 Ct) va ser del 50,3% i el valor Ct alt (36–40 Ct) va ser del 3,2%. 1 el percentatge del valor Ct més baix (< 20 Ct) de l'assaig Abbott SARS-CoV-2 (gen combinat RdRp i N) va ser del 87,6% i el valor Ct del gen ORF1a/b de l'assaig Sansure Biotech 2019-nCoV va mostrar que el percentatge de valor Ct baix (< 20 Ct) va ser del 50,3% i el valor Ct alt (36–40 Ct) va ser del 3,2%.Com es mostra a la figura.1, процент наименьшего значения Ct (< 20 Ct) анализа Abbott SARS-CoV-2 (комбинированный ген RdRp и N) 6%, 8 тав и N) значение Ct гена ORF1a/b анализа Sansure Biotech 2019-nCoV показало что процент низкого значения Ct (< 20%, лста) а высокое значение Ct (36–40 Ct) составляло 3,2%. 1, el percentatge del valor Ct més baix (< 20 Ct) de l'anàlisi del SARS-CoV-2 d'Abbott (gen combinat RdRp i N) va ser del 87,6%, i l'anàlisi del valor Ct del gen ORF1a/b de Sansure Biotech 2019-nCoV va mostrar que el percentatge de valor Ct baix (< 20 Ct) representava el 50,3% i el Ct de valor alt (36–40 Ct) representava el 3,2%.如图1 所示，Abbott SARS-CoV-2 检测（结合RdRp 和N 基因）的最低Ct 值百分比（< 20%，San Biotecnologia，876. 2019-nCoV 检测的ORF1a/b 基因Ct 值显示低Ct 值(< 20 Ct) 的百分比为50,3%，高Ct 值(36)–40 Ct (36)–40的百分比为3,2%. Com es mostra a la Figura 1, el percentatge de valor Ct més baix (< 20 Ct) de la prova Abbott SARS-CoV-2 (combinació del gen RdRp i N) és del 87,6%, el valor Ct del gen ORF1a/b de la prova Sansure Biotech 2019-nCoV mostra un percentatge de Ct baix (< 20 Ct) del 50,3%, i el percentatge de Ct (36–40 Ct) del 3,2%. Как показано на рисунке 1, анализ Abbott SARS-CoV-2 (сочетающий гены RdRp и N) имел самое низкое низкое ннтроец н Ct (< 20 Ct) в размере 87,6%, а значение Ct гена ORF1a/b в исследовании Sansure Biotech 2019- Анализ nCoV покат.зка Com es mostra a la Figura 1, l'assaig Abbott SARS-CoV-2 (combinant els gens RdRp i N) va tenir el valor Ct percentual més baix (< 20 Ct) amb un 87,6%, mentre que el valor Ct del gen ORF1a/b a l'estudi de Sansure Biotech 2019: l'anàlisi de nCoV va mostrar un Ct baix. Процент значений (< 20 Ct) составил 50,3%, а процент высоких значений Ct (36–40 Ct) составил 3,2%. El percentatge de valors (< 20 Ct) va ser del 50,3%, i el percentatge de valors de Ct alts (36–40 Ct) va ser del 3,2%.La prova B d'Abbott per al SARS-CoV-2 va registrar valors de Ct superiors a 30. D'altra banda, en l'assaig BGI SARS-CoV-2, el gen ORF1a/b va tenir un valor Ct alt (> 36 Ct), el percentatge va ser del 4% (Fig. 1). D'altra banda, en l'assaig BGI SARS-CoV-2, el gen ORF1a/b va tenir un valor Ct alt (> 36 Ct), el percentatge va ser del 4% (Fig. 1). С другой стороны, в анализе BGI SARS-CoV-2 ген ORF1a/b имел высокое значение Ct (> 36 Ct), процент котол 4% (рис. 1). D'altra banda, en l'anàlisi de BGI, el gen ORF1a/b del SARS-CoV-2 va tenir un valor Ct alt (> 36 Ct), el percentatge del qual va ser del 4% (Fig. 1).另一方面，在BGI SARS-CoV-2 检测中，ORF1a/b 基因具有高Ct 值（> 36 Ct）的百分比一分比一帀4% D'altra banda, en la detecció de SARS-CoV-2 per BGI, el percentatge del gen ORF1a/b amb un valor Ct alt (>36 Ct) és del 4% (Figura 1). С другой стороны, в анализе BGI SARS-CoV-2 процент генов ORF1a/b с высокими значениями Ct (>36 Ct) со 4% (>36 Ct) сос. D'altra banda, en l'anàlisi BGI SARS-CoV-2, el percentatge de gens ORF1a/b amb valors de Ct elevats (>36 Ct) va ser del 4% (Fig. 1).
En aquest estudi, vam prendre 164 mostres nasofaríngies. Per a tots els tipus d'assajos, l'aïllament i l'amplificació de l'ARN es van realitzar utilitzant els mètodes i kits recomanats pels respectius fabricants.
Aquest estudi va demostrar que la prova d'Abbott per al SARS-CoV-2 té el mateix rendiment de detecció que la CRS, amb un 100% de positius, negatius i concordança general. La concordança kappa de Cohen és d'1,00, cosa que indica una concordança total amb la CRS. Un estudi similar realitzat per la Universitat de Washington als EUA va trobar que la sensibilitat i l'especificitat generals de la prova d'Abbott per al SARS-CoV-2 eren del 93% i el 100%, respectivament, en comparació amb l'assaig determinat pel laboratori (LDA) dels CDC. 11. El sistema de detecció del SARS-CoV-2 d'Abbott es basa en la detecció combinada simultània dels gens N i RdRp, ja que tots dos gens són més sensibles, cosa que minimitza els falsos negatius12. Un estudi realitzat a Viena, Àustria, també va mostrar que els grans volums de mostra d'extracció i els volums d'eluent de detecció minimitzaven els efectes de dilució i augmentaven l'eficiència de detecció13. Així, la combinació perfecta d'Abbott per a l'assaig SARS-CoV-2 es pot associar amb un sistema de detecció de plataforma que detecta simultàniament gens combinatoris, extreu un gran nombre de mostres (0,5 ml) i utilitza una gran quantitat d'eluent (40 µl).
Els nostres resultats també van mostrar que el rendiment de detecció de la prova genètica Daan era gairebé el mateix que el de la CRS. Això és coherent amb un estudi14 realitzat a la Universitat d'Anhui a Huainan, Xina, i l'afirmació del fabricant d'una concordança positiva del 100%. Malgrat els informes de resultats consistents, una mostra va donar un fals negatiu després de tornar a analitzar el mateix eluat, però va ser positiva en els assaigs d'Abbott SARS-CoV-2 i Sansure Biotech nCoV-2019. Això suggereix que hi pot haver variabilitat en els resultats entre diferents tipus d'assaigs. No obstant això, en l'estudi realitzat a la Xina15, el resultat de l'assaig del gen Daan va ser significativament diferent (p < 0,05) en comparació amb el seu assaig de referència definit al laboratori. No obstant això, en l'estudi realitzat a la Xina15, el resultat de l'assaig del gen Daan va ser significativament diferent (p < 0,05) en comparació amb el seu assaig de referència definit al laboratori. Тем не менее, в исследовании, проведенном в Китае15, результат анализа Daan Gene значителенном в Китае15, результат анализа Daan Gene значителенном (5) их лабораторного эталонного анализа. No obstant això, en un estudi a la Xina15, el resultat de l'anàlisi de Daan Gene va ser significativament diferent (p < 0,05) de la seva anàlisi de referència de laboratori.然而，在中国进行的研究中15，大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差异（p < 0,05).然而，在中国进行的研究中15，大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差<0,05 Однако в исследовании, проведенном в Китае15, результаты генетического теста Daan значитель 0,05) по сравнению с его эталонным лабораторным тестом. No obstant això, en un estudi a la Xina15, els resultats de la prova genètica de Daan van ser significativament diferents (p < 0,05) en comparació amb la seva prova de laboratori de referència.Aquesta discrepància pot ser deguda a la sensibilitat de la prova de referència per detectar el SARS-CoV-2, i poden ser importants més estudis per determinar-ne la causa.
A més, el nostre estudi va avaluar el rendiment comparatiu de l'assaig BGI del SARS-CoV-2 amb el CRS, mostrant un excel·lent percentatge de concordança positiva (PPA = 97,9%), un percentatge de concordança negativa (NPA = 100%) i un percentatge de concordança general per sexe (OPA). = 98,8%). Els valors Kappa de Cohen van mostrar una bona concordança (K = 0,975). Estudis als Països Baixos16 i la Xina15 han mostrat resultats consistents. La prova BGI del SARS-CoV-2 és una prova de detecció d'un sol gen (ORF1a/b) que utilitza 10 µl d'eluat d'amplificació/detecció. Malgrat la bona concordança estadística amb els nostres resultats de referència, l'anàlisi va perdre dues mostres positives (1,22%) de la mostra total. Això pot tenir enormes implicacions clíniques per a la dinàmica de transmissió tant a nivell de pacient com de comunitat.
Una altra anàlisi comparativa inclosa en aquest estudi va ser l'assaig rRT-PCR (RUO) de Sansure Biotech nCoV-2019; el percentatge de coincidència global va ser del 96,3%. La força de la concordança també es va determinar mitjançant el valor Kappa de Cohen, que va ser de 0,925, cosa que indica una concordança total amb la CRS. De nou, els nostres resultats són idèntics als estudis realitzats a la Universitat Central del Sud de Changsha, Xina, i al Departament de Laboratori Clínic de l'Hospital Popular de Liuzhou, ciutat de Liuzhou, Xina17. Tot i que es va registrar la bona concordança estadística esmentada, la prova de khi quadrat (prova de MacNemar) va mostrar que el resultat de l'assaig de Sansure Biotech ha tingut una diferència estadísticament significativa en comparació amb CRS (p < 0,005). Tot i que es va registrar la bona concordança estadística esmentada, la prova de khi quadrat (prova de MacNemar) va mostrar que el resultat de l'assaig de Sansure Biotech ha tingut una diferència estadísticament significativa en comparació amb CRS (p < 0,005). Несмотря на то, что было зафиксировано указанное выше хорошее статистическое сототировано указанное выше хорошее статистическое сототировано хи-квадрат (критерий Макнемара) показал, что результат анализа Sansure Biotech имеет статистичесри злесери злеска зализа по сравнению с CRS (p <0,005). Tot i que es va registrar la bona concordança estadística anterior, la prova de khi quadrat (prova de McNemar) va mostrar que el resultat de l'assaig de Sansure Biotech tenia una diferència estadísticament significativa en comparació amb el CRS (p < 0,005).尽管记录了上述良好的统计一致性，但卡方检验（MacNemar 检验）表明，但卡方检验（MacNemar 检验）表明，但卡方检验）表明，但卡方检暵暞暗暞暗相比具有统计学显着差异（p < 0,005）.尽管 记录 了 上述 良好 统计 一致性 ， 但 检验 （（macnemar 检验 表明 ， biotech ， 检验 ，与 crs 相比 具有 显着 （（p <0,005。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。＼。。）） Несмотря на отмеченное выше хорошее статистическое соответствие, критерий хи-квадрат (критерий хи-квадратрат) (критерий хи-квадратрат) показал статистически значимую разницу (p < 0,005) между анализом Sansure Biotech i CRS. Malgrat la bona concordança estadística esmentada anteriorment, la prova de khi quadrat (prova de McNemar) va mostrar una diferència estadísticament significativa (p < 0,005) entre l'assaig de Sansure Biotech i el CRS.Sis mostres (3,66%) van resultar falsos negatius en comparació amb la CRS (Taula suplementària 1); això és molt important, sobretot tenint en compte la dinàmica de transmissió del virus. Les dades anteriors també avalen aquesta baixa taxa de detecció15.
En aquest estudi, es van determinar els valors de Ct per a cada assaig i plataforma respectiva, amb el valor mitjà de Ct més baix reportat a l'assaig Abbott SARS-CoV-2. Aquest resultat pot estar relacionat amb el sistema de proves genètiques combinades simultànies d'Abbott per a la detecció del SARS-CoV-2. Per tant, segons la Figura 1, el 87,6% dels resultats d'Abbott SARS-CoV-2 tenien valors de Ct inferiors a 20. Només un petit nombre de resultats de mostres (12,4%) es trobaven en el rang de 20-30. No es van registrar valors de Ct superiors a 30. A més de l'ús per part d'Abbott del format de proves genètiques de panell SARS-CoV-2, aquest resultat pot estar relacionat amb el límit inferior de detecció (32,5 còpies d'ARN/ml)18, que és tres vegades inferior al límit inferior de l'empresa de 100 còpies d'ARN/ml)19.
Aquest estudi té algunes limitacions: en primer lloc, no disposem de mètodes estàndard/de referència [com ara la càrrega viral o altres proves de laboratori (LDA)] a causa de la manca de recursos. En segon lloc, totes les mostres utilitzades en aquest estudi eren hisops nasofaringis, mentre que els resultats no eren aplicables a altres tipus de mostres, i en tercer lloc, la mida de la nostra mostra era petita.
Aquest estudi va comparar el rendiment de quatre assaigs de rRT-PCR per al SARS-CoV-2 utilitzant mostres nasofaríngies. Tots els assaigs de detecció van tenir un rendiment gairebé comparable, amb l'excepció de l'assaig de Sansure Biotech. A més, es va identificar una baixa taxa de positivitat a l'assaig de Sansure Biotech en comparació amb el CRS (p < 0,05). A més, es va identificar una baixa taxa de positivitat a l'assaig de Sansure Biotech en comparació amb el CRS (p < 0,05). Кроме того, в тесте Sansure Biotech был выявлен низкий процент положительных результатов по срав нсне5 (CRS, CRS5). A més, la prova de Sansure Biotech va mostrar un baix percentatge de resultats positius en comparació amb CRS (p < 0,05).此外，与CRS 相比，Sansure Biotech 检测的阳性率较低(p <0,05)。此外，与CRS 相比，Sansure Biotech 检测的阳性率较低(p <0,05)。 Кроме того, анализ Sansure Biotech имел более низкий уровень положительных результатов по сравен, CRS5 (CRS5). A més, l'assaig de Sansure Biotech va tenir una taxa de positivitat més baixa en comparació amb el CRS (p < 0,05).L'anàlisi de Sansure Biotech nCoV-2019 (RUO) de PPA, NPA i concordança general va superar el 93,5% amb un valor de concordança de força Cohen Kappa de 0,925. Finalment, l'assaig de Sansure Biotech (RUO) necessita una validació addicional per al seu ús a Etiòpia, i s'hauria de considerar la possibilitat de fer més investigacions per avaluar les afirmacions dels fabricants individuals.
El disseny d'un estudi comparatiu es va dur a terme en quatre centres sanitaris d'Addis Abeba: l'Hospital Eka Kotebe, el Centre de Tractament de l'Església del Mil·lenni, l'Hospital Memorial Zewooditu i l'Hospital Especialitzat en Tuberculosi de St. Peter. Les dades es van recollir entre l'1 i el 31 de desembre de 2020. Els centres mèdics per a aquest estudi es van escollir a propòsit en funció del seu elevat nombre de casos i la disponibilitat dels principals centres de tractament a la ciutat. De la mateixa manera, els instruments, inclosos els instruments de PCR en temps real ABI 7500 i Abbott m2000, es van seleccionar d'acord amb les recomanacions dels fabricants de reactius NAAT, i es van seleccionar quatre kits de detecció de PCR per a aquest estudi, ja que la majoria de laboratoris d'Etiòpia utilitzaven almenys quatre d'ells. Prova genètica, prova Abbott SARS-CoV-2, prova Sansure Biotech i prova BGI SARS-CoV-2 realitzades durant l'estudi.
Les proves per al SARS-CoV-2 es van dur a terme de l'1 al 30 de desembre de 2020 utilitzant 3 ml de medi de transport viral (VTM) (Miraclean Technology, Shenzhen, Xina) d'individus sota investigació per COVID-19 derivats a l'EPHI. Les mostres nasofaríngies van ser recollides per recol·lectors de mostres formats i enviades a l'EPHI en paquets triples. Abans de l'aïllament de l'àcid nucleic, a cada mostra se li assigna un número d'identificació únic. L'extracció es realitza de cada mostra immediatament després de l'arribada mitjançant mètodes d'extracció manuals i automàtics. Per tant, per a l'extracció automàtica d'Abbott m2000, es van extreure 1,3 ml (inclosos 0,8 ml de volum mort i 0,5 ml de volum d'entrada d'extracció) de la mostra de cada mostra i es van passar pel sistema de preparació de mostres d'ADN d'Abbott (Abbott Molecular Inc. des Plaines, IL, EUA). ) Es va incloure un lot de 96 [92 mostres, dos controls de detecció i dos controls sense plantilla (NTC)] en el procés general (recuperació i detecció) de dues rondes de mineria de SARS-CoV-2 (EUA) en temps real. De la mateixa manera, per a l'extracció manual, utilitzeu les mateixes mostres (per a l'extracció i el descobriment automàtics). Així, durant tot el procés, es van aliquotar i extreure mostres de 140 µl mitjançant el kit QIAamp Viral RNA Mini (QIAGEN GmbH, Hilden, Alemanya) en lots de 24 (incloses 20 mostres, dos controls d'assaig i dos NTC) durant nou rondes. Els eluats extrets manualment es van amplificar i detectar mitjançant un termociclador ABI 7500 mitjançant l'assaig SARS-CoV-2 BGI, l'assaig Daan Gene i l'assaig Sansure Biotech.
L'aïllament i la purificació automatitzats de l'ARN viral del SARS-CoV-2 segueixen el principi de les perles magnètiques utilitzant reactius de preparació de mostres d'ADN d'Abbott. La inactivació de les mostres i la solubilització de les partícules virals es duu a terme utilitzant un detergent que conté isotiocianat de guanidina per desnaturalitzar la proteïna i inactivar l'ARNasa. A continuació, l'ARN se separa de la proteïna mitjançant la separació en fase sòlida utilitzant sílice, és a dir, la sal de guanidini i el pH alcalí del tampó de lisi promouen la unió dels àcids nucleics a la sílice (SiO2). El pas d'esbandida elimina les proteïnes i les restes restants per produir una solució clara. L'ARN transparent s'aïlla de micropartícules a base de sílice utilitzant el camp magnètic de l'instrument20,21. D'altra banda, l'aïllament i la purificació manuals de l'ARN es duen a terme mitjançant el mètode de columna de centrifugació utilitzant centrifugació en lloc d'un suport magnètic i separació de micropartícules de l'eluent.
La prova de detecció del SARS-CoV-2 en temps real d'Abbott (Abbott Molecular, Inc.) es va dur a terme segons les instruccions del fabricant, que va rebre EUA19,22 de l'OMS i la FDA. En aquest protocol, la inactivació de la mostra abans de l'extracció es va realitzar en un bany d'aigua a 56 °C durant 30 min. Després de la inactivació del virus, l'extracció d'àcids nucleics es va realitzar en un instrument Abbott m2000 SP a partir de 0,5 ml de VTM utilitzant un sistema de preparació de mostres d'ADN Abbott m2000, segons el fabricant. L'amplificació i la detecció es van realitzar mitjançant un instrument Abbott m2000 RT-PCR, i es va realitzar una detecció dual per als gens RdRp i N. ROX) i VIC P (colorant patentat) per a la focalització i detecció de controls interns, permetent la detecció simultània d'ambdós productes d'amplificació 19.
El mètode de detecció d'amplificació d'aquest kit es basa en la tecnologia RT-PCR d'un sol pas. Els gens ORF1a/b i N van ser seleccionats com a regions conservades per Daan Gene Technology per detectar l'amplificació de la regió diana. S'han dissenyat encebadors específics i sondes fluorescents (sondes del gen N marcades amb FAM, sondes ORF1a/b marcades amb VIC) per detectar l'ARN del SARS-CoV-2 en mostres. L'eluent final i les mescles mestres es van preparar afegint 5 µl d'eluent a 20 µl de la mescla mestre fins a un volum final de 25 µl. L'amplificació i la detecció es van realitzar simultàniament en un instrument de PCR en temps real ABI 750024.
Els gens ORF1a/b i N es van detectar utilitzant el kit de diagnòstic d'àcids nucleics nCoV-2019 de Sansure Biotech (detecció per PCR fluorescent). Prepareu sondes específiques per a cada gen diana seleccionant el canal FAM per a la regió ORF1a/b i el canal ROX per al gen N. A aquest kit d'assaig, s'afegeixen l'eluent i els reactius de la barreja mestra de la manera següent: prepareu 30 µl de reactiu de la barreja mestra i 20 µl de mostra eluïda per a la detecció/amplificació. Per a la PCR en temps real es va utilitzar l'ABI 750025 per a l'amplificació/detecció.
La prova BGI del SARS-CoV-2 és un kit de rRT-PCR en temps real fluorescent per al diagnòstic de la COVID-19. La regió diana es troba a la regió ORF1a/b del genoma del SARS-CoV-2, que és un mètode de detecció d'un sol gen. A més, el gen humà β-actina és un gen diana regulat internament. La barreja mestra es prepara barrejant 20 µl del reactiu de la barreja mestra i 10 µl de la mostra d'ARN extreta en una placa de pous26. Es va utilitzar un instrument de PCR quantitativa en temps real fluorescent ABI 7500 per a l'amplificació i la detecció. Tota l'amplificació d'àcids nucleics, les condicions d'execució de la PCR per a cada assaig i la interpretació dels resultats es van realitzar d'acord amb les instruccions del fabricant respectiu (Taula 3).
En aquesta anàlisi comparativa, no vam utilitzar el mètode estàndard de referència per determinar el percentatge de concordança (positiu, negatiu i global) i altres paràmetres de comparació per a les quatre anàlisis. Cada comparació de proves es va fer amb CRS, en aquest estudi la CRS es va establir per la regla "qualsevol positiu" i el resultat es va determinar, no per una sola prova, vam utilitzar almenys dos resultats de proves coincidents. A més, en el cas de la transmissió de la COVID-19, els resultats falsos negatius són més perillosos que els resultats falsos positius. Per tant, per dir "positiu" amb la màxima precisió possible a partir d'un resultat de CRS, almenys dues proves d'assaig han de ser positives, és a dir, que és probable que almenys un resultat positiu provingui d'un assaig EUA. Així, de quatre resultats de proves, dos o més resultats de proves que donen el mateix resultat es consideren veritables positius o negatius18,27.
Les dades es van recollir mitjançant formularis estructurats d'extracció de dades, l'entrada i l'anàlisi de dades es van dur a terme amb el programari estadístic Excel i SPSS versió 23.0 per a estadístiques descriptives. Es va analitzar la concordança positiva, negativa i percentual global, i es va utilitzar una puntuació Kappa per determinar el grau de concordança de cada mètode amb la CRS. Els valors Kappa s'interpreten de la següent manera: 0,01 a 0,20 per a una concordança lleu, 0,21 a 0,40 per a una concordança general, 0,41-0,60 per a una concordança moderada, 0,61-0,80 per a una concordança important i 0,81-0,99 per a una concordança completa28.
Es va obtenir l'autorització ètica de la Universitat d'Addis Abeba i tots els protocols experimentals per a aquest estudi van ser aprovats pel Consell de Revisió d'Ètica Científica de l'Institut de Salut Pública d'Etiòpia. El número de referència de la Llicència Ètica de l'EPHI és EPHI/IRB-279-2020. Tots els mètodes es van aplicar d'acord amb les recomanacions i disposicions de les Directrius Nacionals Integrals d'Etiòpia per al Tractament de la COVID-19. A més, es va obtenir el consentiment informat per escrit de tots els participants de l'estudi abans de la participació a l'estudi.
Totes les dades obtingudes o analitzades en aquest estudi s'inclouen en aquest article publicat. Les dades que donen suport als resultats d'aquest estudi estan disponibles per a l'autor respectiu si es sol·liciten de manera raonable.
Organització Mundial de la Salut. Recomanacions per a estratègies de proves de laboratori per a la COVID-19: Guia provisional, 21 de març de 2020 Núm. WHO/2019-nCoV/lab_testing/2020.1 (OMS, 2020).
Mouliou, DS, Pantazopoulos, I. i Gourgoulianis, KI Diagnòstic intel·ligent de la COVID-19 al servei d'urgències: tot en pràctica. Mouliou, DS, Pantazopoulos, I. i Gourgoulianis, KI Diagnòstic intel·ligent de la COVID-19 al servei d'urgències: tot en pràctica.Muliou, DS, Pantazopoulos, I. i Gurgulianis, KI Diagnòstic intel·ligent de COVID-19 al servei d'urgències: tot a la pràctica.Muliou DS, Pantazopoulos I. i Gurgulyanis KI Diagnòstic intel·ligent de COVID-19 als serveis d'urgències: integració integral a la pràctica. Expert Reverend Respire. medicine. 3, 263–272 (2022).
Mitchell, SL i St George, K. Avaluació de l'assaig COVID19 ID NOW EUA. Mitchell, SL i St George, K. Avaluació de l'assaig COVID19 ID NOW EUA.Mitchell, SL i St. George, K. Avaluació de l'assaig COVID19 ID NOW EUA.Mitchell SL i St. George K. Avaluació de l'assaig COVID19 ID NOW EUA. J. Clinical. Virus. 128, 104429. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104429 (2020).
OMS. Detecció de laboratori de la malaltia per coronavirus 2019 (COVID-19) en sospites de malaltia humana. https://www.who.int/publications/i/item/10665-331501 (consultat el 15 d'agost de 2020) (OMS, 2020).
Udugama, B. et al. Diagnòstic de la COVID-19: Malalties i eines de prova. ACS Nano 14(4), 3822–3835 (2020).
Syed S. et al. Establiment del Col·legi de Patòlegs de l'Àfrica Oriental, Central i Austral – Escola Regional de Patologia de l'Orient Mitjà i Sud-àfrica. Àfrica. J. Lab. medicine. 9(1), 1-8 (2020).
Institut Etíop de Salut Pública, Ministeri Federal de Salut. Estratègia i guia nacional provisional per al diagnòstic de laboratori de la COVID-19. https://ephi.gov.et/images/novel_coronavirus/EPHI_PHEOC_COVID-19_Laboratory_Diagnosis_Eng.pdf (consultat el 12 d'agost de 2020) (EPHI, 2020).
Woloshin, S., Patel, N. i Kesselheim, AS Proves falsos negatives per a la infecció per SARS-CoV-2, reptes i implicacions. Woloshin, S., Patel, N. i Kesselheim, AS Proves falsos negatives per a la infecció per SARS-CoV-2, reptes i implicacions.Voloshin S., Patel N. i Kesselheim AS Proves falsos negatives per a infeccions per SARS-CoV-2 i les seves conseqüències.Voloshin S., Patel N. i Kesselheim AS Proves de provocació amb resultats falsos negatius i l'impacte de la infecció per SARS-CoV-2. N. eng. J. Medicine. 383(6), e38 (2020).
Mouliou, DS i Gourgoulianis, KI Casos falsos positius i falsos negatius de COVID-19: estratègies de prevenció i gestió respiratòria, vacunació i altres perspectives. Mouliou, DS i Gourgoulianis, KI Casos falsos positius i falsos negatius de COVID-19: estratègies de prevenció i gestió respiratòria, vacunació i altres perspectives. Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI Ложноположительные и ложноотрицательные случаи COVID-19: респираторная проспигительные прострицательные случаи лечения, вакцинация i дальнейшие перспективы. Mouliou, DS i Gourgoulianis, KI Casos falsos positius i falsos negatius de COVID-19: estratègies de prevenció i tractament respiratori, vacunació i el camí a seguir.Muliu, DS i Gurgulianis, KI Casos falsos positius i falsos negatius de COVID-19: estratègies per a la prevenció i el tractament respiratori, vacunació i el camí a seguir. Expert Reverend Respire. medicine. 15(8), 993–1002 (2021).
Mouliou, DS, Ioannis, P. i Konstantinos, G. Diagnòstic de COVID-19 al servei d'urgències: veure l'arbre però perdre el bosc. Mouliou, DS, Ioannis, P. i Konstantinos, G. Diagnòstic de COVID-19 al servei d'urgències: veure l'arbre però perdre el bosc.Mouliou, DS, Ioannis, P. i Konstantinos, G. Diagnòstic de la COVID-19 al servei d'urgències: veure l'arbre, perdre el bosc.Muliou DS, Ioannis P. i Konstantinos G. Diagnòstic de la COVID-19 a urgències: no hi ha prou bosc per als arbres. Appear. medicine. J. https://doi.org/10.1136/emermed-2021-212219 (2022).
Degli-Angeli, E. et al. Validació del rendiment analític i clínic de l'assaig Abbott RealTime SARS-CoV-2. J. Clinical. Virus. 129, 104474. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104474 (2020).
Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. i Aflatoonian, B. Comparació de cinc conjunts de primers de diferents regions del genoma de la COVID-19 per a la detecció d'infecció per virus mitjançant RT-PCR convencional. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. i Aflatoonian, B. Comparació de cinc conjunts de primers de diferents regions del genoma de la COVID-19 per a la detecció d'infecció per virus mitjançant RT-PCR convencional.Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. i Aflatunyan, B. Comparació de cinc conjunts de primers de diferents regions del genoma de la COVID-19 per a la detecció d'infecció viral mitjançant RT-PCR convencional. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. i Aflatoonian, B. 比较来自COVID-19不同基因组区域的五个引物组，用于通过常规RT-PCR 检测病毒感染。 Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. i Aflatoonian, B. Comparació de 5 regions genètiques diferents de la COVID-19 per a la detecció d'infecció viral mitjançant RT-PCR convencional.Mollaei HR, Afshar AA, Kalantar-Neyestanaki D, Fazlalipour M. i Aflatunyan B. Comparació de cinc conjunts de primers de diferents regions del genoma de la COVID-19 per a la detecció d'infecció viral mitjançant RT-PCR convencional.Iran. J. Microbiologia. 12(3), 185 (2020).
Goertzer, I. et al. Resultats preliminars del programa nacional d'avaluació externa de la qualitat per a la detecció de seqüències del genoma del SARS-CoV-2. J. Clinical. Virus. 129, 104537. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104537 (2020).
Wang, M. et al. Avaluació analítica de l'eficàcia de cinc kits de RT-PCR per a la síndrome respiratòria aguda greu per coronavirus 2. J. Clinical. laboratorium. anus. 35(1), e23643 (2021).
Wang B. et al. Avaluació de set kits de detecció d'ARN del SARS-CoV-2 disponibles comercialment a la Xina basats en la reacció en cadena de la polimerasa (PCR) en temps real. Clínica. Química. Laboratori. Medicina. 58(9), e149–e153 (2020).
van Casteren, PB et al. Comparació de set kits de diagnòstic comercials de RT-PCR per a la COVID-19. J. Clinical. Virus. 128, 104412 (2020).
Lu, Yu, et al. Comparació del rendiment diagnòstic de dos kits de PCR per a la detecció d'àcids nucleics del SARS-CoV-2. J. Clinical. laboratory. anus. 34(10), e23554 (2020).
Lefart, PR, etc. Un estudi comparatiu de quatre plataformes de proves d'amplificació d'àcids nucleics (NAAT) del SARS-CoV-2 va mostrar que el rendiment d'ID NOW es degradava significativament segons el pacient i el tipus de mostra. diagnòstic. microbiologia. Infect. diss. 99(1), 115200 (2021).
Molècula d'Abbott. Prospecte de l'anàlisi en temps real del SARS-CoV-2 d'Abbott. https://www.molecular.abbott/us/en/products/infectious-disease/RealTime-SARS-CoV-2-Assay. 1-12. (A 10 d'agost de 2020) (2020).
Klein, S. et al. Aïllament d'ARN del SARS-CoV-2 mitjançant microesferes magnètiques per a una detecció ràpida a gran escala mitjançant RT-qPCR i RT-LAMP. Virus 12(8), 863 (2020).