Realització de quatre assajos d'amplificació d'àcids nucleics per identificar SARS-CoV-2 a Etiòpia

Gràcies per visitar Nature.com. Esteu utilitzant una versió del navegador amb suport CSS limitat. Per obtenir la millor experiència, us recomanem que utilitzeu un navegador actualitzat (o desactiveu el mode de compatibilitat a Internet Explorer). A més, per garantir un suport permanent, mostrem el lloc sense estils ni JavaScript.
Mostra un carrusel de tres diapositives alhora. Utilitzeu els botons Anterior i Següent per moure's per tres diapositives alhora, o utilitzeu els botons lliscants al final per moure's per tres diapositives alhora.
Des de l'esclat de la malaltia del coronavirus (COVID-19) del 2019, s'han desenvolupat moltes proves comercials d'amplificació d'àcids nucleics (NAAT) arreu del món i s'han convertit en assajos estàndard. Tot i que es van desenvolupar i aplicar ràpidament diverses proves a proves de diagnòstic de laboratori, el rendiment d'aquestes proves no s'ha avaluat en diversos entorns. Per tant, aquest estudi tenia com a objectiu avaluar el rendiment dels assajos Abbott SARS-CoV-2, Daan Gene, BGI i Sansure Biotech mitjançant l'estàndard de referència compost (CRS). L'estudi es va dur a terme a l'Institut de Salut Pública d'Etiòpia (EPHI) de l'1 al 30 de desembre de 2020. Es van extreure 164 mostres nasofaríngies mitjançant el mini kit d'ARN QIAamp i el sistema de preparació de mostres d'ADN Abbott. De 164 exemplars, el 59,1% van ser positius i el 40,9% van ser negatius per a CRS. La positivitat de Sansure Biotech va ser significativament baixa en comparació amb CRS (p <0,05). La positivitat de Sansure Biotech va ser significativament baixa en comparació amb CRS (p <0,05). Положительные результаты Sansure Biotech были значительно ниже по сравнению с CRS (p < 0,05). Els resultats positius de Sansure Biotech van ser significativament inferiors en comparació amb CRS (p <0,05).与CRS 相比，Sansure Biotech 的阳性率显着较低（p <0,05）。与CRS 相比，Sansure Biotech 的阳性率显着较低（p <0,05）。 У Sansure Biotech было значительно меньше положительных результатов по сравнению с CRS (p < 0,05). Sansure Biotech va tenir significativament menys resultats positius en comparació amb CRS (p <0,05).L'acord global de les quatre anàlisis va ser del 96,3 al 100% en comparació amb el CRS. A més de la baixa taxa de positivitat de l'assaig Sansure Biotech, el rendiment dels quatre assajos era gairebé comparable. Com a tal, l'assaig Sansure Biotech [Research Only (RUO)] requereix una validació addicional per al seu ús a Etiòpia. Finalment, s'hauria de considerar investigacions addicionals per avaluar els assaigs amb les afirmacions adequades del fabricant.
Les proves de laboratori formen part del Pla estratègic de preparació i resposta de la malaltia del coronavirus 2019 (COVID-19) de l'Organització Mundial de la Salut (OMS). L'OMS aconsella que els països han de crear capacitat de laboratori per millorar la preparació, la gestió adequada dels casos, la vigilància i la resposta ràpida als reptes de salut pública. Això suggereix que el paper del laboratori és clau per caracteritzar la malaltia i l'epidemiologia dels agents infecciosos emergents i controlar-ne la propagació.
El diagnòstic de la COVID-19 requereix informació epidemiològica i mèdica, símptomes/signes personals i dades radiogràfiques i de laboratori2. Des que es va informar del brot de COVID-19 a Wuhan, Xina, s'han desenvolupat moltes proves comercials d'amplificació d'àcids nucleics (NAAT) arreu del món. La reacció en cadena de la polimerasa de transcripció inversa en temps real (rRT-PCR) s'ha utilitzat com a mètode habitual i estàndard per al diagnòstic de laboratori de la infecció de la síndrome respiratòria aguda severa 2 (SARS-CoV-2)3. La detecció molecular del SARS-CoV-2 es basa normalment en els gens N (gen de la proteïna nucleocàpsida), E (gen de la proteïna de l'embolcall) i RdRp (gen de la ARN polimerasa dependent de l'ARN) a ORF1a/b (marc de lectura obert 1a/b) . gen) regió identificada a partir del genoma viral. Es consideren les principals regions conservades que es troben en els genomes virals per al reconeixement de virus4. Entre aquests gens, els gens RdRp i E tenen una alta sensibilitat de detecció analítica, mentre que el gen N té una baixa sensibilitat analítica5.
El rendiment dels assaigs de PCR pot variar en funció de diversos factors com ara: reactius d'extracció, reactius d'amplificació/detecció, mètode d'extracció, qualitat de la màquina de PCR i altres instruments. A l'abril de 2020, més de 48 dispositius de diagnòstic diferents de nou països han rebut l'autorització d'ús d'emergència (EUA) per al diagnòstic de la COVID-196. A Etiòpia, s'utilitzen més de 14 plataformes de PCR en temps real per a la detecció de SARS-CoV-2 per PCR a 26 institucions de salut pública, incloses ABI 7500, Abbott m2000, Roche 48000 i Quant-studio7. A més, hi ha disponibles diversos kits de prova de PCR, com ara la prova Daan Gene, la prova Abbott SARS-CoV-2, la prova Sansure Biotech i la prova SARS-CoV-2 BGI. Tot i que la rRT-PCR és altament sensible, alguns pacients amb COVID-19 informen de resultats falsos negatius a causa de còpies insuficients d'àcid ribonucleic viral (ARN) a les mostres a causa d'una recollida, transport, emmagatzematge i manipulació inadequats i proves de laboratori. condicions i actuacions del personal8. A més, la manipulació incorrecta de la mostra o el control, la configuració del llindar del cicle (Ct) i la reactivitat creuada amb altres àcids nucleics patògens o ARN SARS-CoV-2 inactiu/residual poden donar lloc a resultats falsos positius en assajos rRT-PCR9. Així, està clar que les proves de PCR poden identificar portadors de fragments de gens, ja que ni tan sols poden distingir entre gens virals realment actius, de manera que les proves només poden identificar portadors i no pacients10. Per tant, és important avaluar el rendiment diagnòstic mitjançant mètodes estàndard en el nostre entorn. Tot i que molts reactius NAAT estan disponibles a l'Institut de Salut Pública d'Etiòpia (EPHI) i a tot el país, encara no s'ha informat cap avaluació comparativa de la seva eficàcia. Per tant, aquest estudi pretenia avaluar el rendiment comparatiu dels kits disponibles comercialment per a la detecció de SARS-CoV-2 mitjançant rRT-PCR mitjançant mostres clíniques.
En aquest estudi es van incloure un total de 164 participants amb sospita de COVID-19. La majoria de les mostres eren de centres de tractament (118/164 = 72%), mentre que els 46 participants restants (28%) eren de centres no de tractament. Entre els participants no tractats al centre, 15 (9,1%) tenien casos de sospita clínica i 31 (18,9%) tenien contactes de casos confirmats. Noranta-tres (56,7%) participants eren homes i l'edat mitjana (± SD) dels participants era de 31,10 (± 11,82) anys.
En aquest estudi, es van determinar taxes positives i negatives de quatre proves per a la COVID-19. Així, les taxes positives de l'assaig Abbott SARS-CoV-2, l'assaig Daan Gene 2019-nCoV, l'assaig SARS-CoV-2 BGI i l'assaig Sansure Biotech 2019-nCoV van ser del 59,1%, 58,5%, 57,9% i 55,5% respectivament. . Les puntuacions de l'estàndard de referència compost (CRS) positives i negatives van ser de 97 (59,1%) i 67 (40,9%), respectivament (taula 1). En aquest estudi, la definició de CRS es va basar en la regla "qualsevol positiu", per la qual dels quatre resultats de la prova, dos o més resultats de la prova que donaven el mateix resultat es consideraven veritablement positius o negatius.
En aquest estudi, hem trobat un percentatge d'acord (NPA) negatiu del 100% (IC del 95% 94,6-100) per a totes les anàlisis en comparació amb CRS. L'anàlisi de Sansure Biotechnology va mostrar un PPA mínim del 93,8% (IC del 95% 87,2-97,1) i l'anàlisi Daan Gene 2019-nCoV va tenir un acord global del 99,4% (IC del 95% 96,6-99,9). En canvi, l'acord global entre l'assaig SARS-CoV-2 BGI i l'assaig Sansure Biotech 2019-nCoV va ser del 98,8% i del 96,3%, respectivament (taula 2).
El coeficient d'acord kappa de Cohen entre els resultats de l'assaig CRS i Abbott SARS-CoV-2 va ser totalment coherent (K = 1,00). De la mateixa manera, els valors kappa de Cohen detectats per Daan Gene 2019-nCoV, SARS-CoV-2 BGI i Sansure Biotech 2019-nCoV també són totalment coherents amb CRS (K ≥ 0,925). En aquesta anàlisi comparativa, la prova de chi quadrat (test McNemar) va mostrar que els resultats de l'assaig Sansure Biotech 2019-nCoV eren significativament diferents dels resultats de CRS (p = 0,031) (taula 2).
Com es mostra a la Fig.1, el percentatge del valor Ct més baix (< 20 Ct) de l'assaig Abbott SARS-CoV-2 (gen RdRp i N combinat) va ser del 87,6% i el valor Ct del gen ORF1a/b de l'assaig Sansure Biotech 2019-nCoV va mostrar que el percentatge de baix El valor de Ct (< 20 Ct) va ser del 50,3% i el valor de Ct elevat (36–40 Ct) va ser del 3,2%. 1, el percentatge del valor Ct més baix (< 20 Ct) de l'assaig Abbott SARS-CoV-2 (gen RdRp i N combinat) va ser del 87,6% i el valor Ct del gen ORF1a/b de l'assaig Sansure Biotech 2019-nCoV va mostrar que el percentatge de baix El valor de Ct (< 20 Ct) va ser del 50,3% i el valor de Ct elevat (36–40 Ct) va ser del 3,2%.Com es mostra a la Fig.1, процент наименьшего значения Ct (< 20 Ct) анализа Abbott SARS-CoV-2 (комбинированный ген RdRp и N) 6%, 8 тав и N) значение Ct гена ORF1a/b анализа Sansure Biotech 2019-nCoV показало что процент низкого значения Ct (< 20%, лста) а высокое значение Ct (36–40 Ct) составляло 3,2%. 1, el percentatge de l'anàlisi del valor Ct més baix (<20 Ct) d'Abbott SARS-CoV-2 (gen combinat RdRp i N) va ser del 87,6% i el valor Ct de l'anàlisi del gen ORF1a/b de Sansure Biotech 2019-nCoV va mostrar que el percentatge de valor Ct baix (< 20 Ct) va representar el 50,3% i el valor Ct alt (36–40 Ct) van representar el 3,2%.如图1 所示，Abbott SARS-CoV-2 检测（结合RdRp 和N 基因）的最低Ct 值百分比（< 20%，San Biotecnologia，876. 2019-nCoV 检测的ORF1a/b 基因Ct 值显示低Ct 值(< 20 Ct) 的百分比为50,3%，高Ct 值(36)–40 Ct (36)–40的百分比为3,2%. Com es mostra a la figura 1, el percentatge de valor Ct més baix (< 20 Ct) de la prova Abbott SARS-CoV-2 (combinació del gen RdRp i N) és del 87,6%, el valor Ct del gen ORF1a/b de la prova Sansure Biotech 2019-nCoV. mostra un percentatge baix de Ct值(< 20 Ct) 的 és del 50,3%, El percentatge de 高Ct 值(36–40 Ct) 的 és del 3,2%. Как показано на рисунке 1, анализ Abbott SARS-CoV-2 (сочетающий гены RdRp и N) имел самое низкое низкое ннтроец н Ct (< 20 Ct) в размере 87,6%, а значение Ct гена ORF1a/b в исследовании Sansure Biotech 2019- Анализ nCoV покат.зка Com es mostra a la figura 1, l'assaig Abbott SARS-CoV-2 (que combina els gens RdRp i N) va tenir el valor Ct percentual més baix (< 20 Ct) al 87, 6%, mentre que el valor Ct del gen ORF1a/b a Sansure Estudi Biotech 2019: l'anàlisi de nCoV va mostrar un Ct baix. Процент значений (< 20 Ct) составил 50,3%, а процент высоких значений Ct (36–40 Ct) составил 3,2%. El percentatge de valors (< 20 Ct) va ser del 50,3%, i el percentatge de valors elevats de Ct (36-40 Ct) va ser del 3,2%.La prova Abbott SARS-CoV-2 B va registrar valors Ct per sobre de 30. D'altra banda, en l'assaig BGI SARS-CoV-2 el gen ORF1a/b tenia un valor Ct elevat (> 36 Ct) el percentatge era del 4% (Fig. 1). D'altra banda, en l'assaig BGI SARS-CoV-2 el gen ORF1a/b tenia un valor Ct elevat (> 36 Ct) el percentatge era del 4% (Fig. 1). С другой стороны, в анализе BGI SARS-CoV-2 ген ORF1a/b имел высокое значение Ct (> 36 Ct), процент котол 4% (рис. 1). D'altra banda, en l'anàlisi del BGI SARS-CoV-2 el gen ORF1a/b va tenir un valor Ct elevat (> 36 Ct), el percentatge del qual va ser del 4% (Fig. 1).另一方面，在BGI SARS-CoV-2 检测中，ORF1a/b 基因具有高Ct 值（> 36 Ct）的百分比一分比一帀4% D'altra banda, en la detecció de BGI SARS-CoV-2, el percentatge del gen ORF1a/b amb un valor Ct elevat (>36 Ct) és del 4% (Figura 1). С другой стороны, в анализе BGI SARS-CoV-2 процент генов ORF1a/b с высокими значениями Ct (>36 Ct) со 4% (>36 Ct) сос. D'altra banda, en l'anàlisi BGI SARS-CoV-2, el percentatge de gens ORF1a/b amb valors elevats de Ct (>36 Ct) va ser del 4% (Fig. 1).
En aquest estudi, vam prendre 164 mostres nasofaríngies. Per a tot tipus d'assajos, l'aïllament i l'amplificació de l'ARN es van realitzar mitjançant els mètodes i kits recomanats pels fabricants respectius.
Aquest estudi va demostrar que la prova d'Abbott per SARS-CoV-2 té el mateix rendiment de detecció que CRS, amb una concordança 100% positiva, negativa i global. L'acord kappa de Cohen és 1,00, cosa que indica un acord total amb CRS. Un estudi similar de la Universitat de Washington als EUA va trobar que la sensibilitat i l'especificitat generals de la prova Abbott per SARS-CoV-2 eren del 93% i del 100%, respectivament, en comparació amb l'assaig determinat en laboratori (LDA) del CDC. . 11. El sistema de detecció Abbott SARS-CoV-2 es basa en la detecció combinada simultània dels gens N i RdRp, ja que tots dos gens són més sensibles, minimitzant els falsos negatius12. Un estudi a Viena, Àustria, també va demostrar que grans volums de mostres d'extracció i volums d'eluents de detecció minimitzaven els efectes de la dilució i augmentaven l'eficiència de la detecció13. Així, la combinació perfecta d'Abbott per a l'assaig SARS-CoV-2 es pot associar amb un sistema de detecció de plataforma que detecta simultàniament gens combinatoris, extreu un gran nombre de mostres (0,5 ml) i utilitza una gran quantitat d'eluent (40 µl).
Els nostres resultats també van mostrar que el rendiment de detecció de la prova genètica Daan era gairebé el mateix que el de CRS. Això és coherent amb un estudi14 realitzat a la Universitat d'Anhui a Huainan, Xina, i amb l'afirmació del fabricant d'acord 100% positiu. Malgrat els informes de resultats consistents, una mostra va ser falsament negativa després de tornar a provar el mateix eluat, però va ser positiva als assajos Abbott SARS-CoV-2 i Sansure Biotech nCoV-2019. Això suggereix que hi pot haver variabilitat en els resultats entre diferents tipus d'assaigs. No obstant això, en l'estudi realitzat a la Xina15, el resultat de l'assaig del gen Daan va ser significativament diferent (p <0, 05) en comparació amb el seu assaig de referència definit al laboratori. No obstant això, en l'estudi realitzat a la Xina15, el resultat de l'assaig del gen Daan va ser significativament diferent (p <0, 05) en comparació amb el seu assaig de referència definit al laboratori. Тем не менее, в исследовании, проведенном в Китае15, результат анализа Daan Gene значителенном в Китае15, результат анализа Daan Gene значителенном (5) их лабораторного эталонного анализа. Tanmateix, en un estudi a la Xina15, el resultat de l'anàlisi de Daan Gene va ser significativament diferent (p <0,05) de l'anàlisi de referència de laboratori.然而，在中国进行的研究中15，大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差异（p < 0,05).然而，在中国进行的研究中15，大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差<0,05 Однако в исследовании, проведенном в Китае15, результаты генетического теста Daan значитель 0,05) по сравнению с его эталонным лабораторным тестом. Tanmateix, en un estudi a la Xina15, els resultats de la prova genètica de Daan van ser significativament diferents (p < 0,05) en comparació amb la seva prova de laboratori de referència.Aquesta discrepància pot ser deguda a la sensibilitat de la prova de referència per detectar SARS-CoV-2, i més estudis poden ser importants per determinar la causa.
A més, el nostre estudi va avaluar el rendiment comparatiu de l'assaig SARS-CoV-2 BGI amb CRS, mostrant un excel·lent acord percentual positiu (PPA = 97,9%), percentatge d'acord negatiu (NPA = 100%) i percentatge d'acord global per gènere ( OPA). ). = 98,8%). Els valors de Kappa de Cohen van mostrar un bon acord (K = 0,975). Els estudis realitzats als Països Baixos16 i la Xina15 han mostrat resultats consistents. La prova SARS-CoV-2 BGI és una prova de detecció d'un sol gen (ORF1a/b) que utilitza 10 µl d'eluït d'amplificació/detecció. Malgrat un bon acord estadístic amb els nostres resultats de referència, l'anàlisi va perdre dues mostres positives (1,22%) de la mostra total. Això pot tenir grans implicacions clíniques per a la dinàmica de transmissió tant a nivell del pacient com de la comunitat.
Una altra anàlisi comparativa inclosa en aquest estudi va ser l'assaig Sansure Biotech nCoV-2019 rRT-PCR (RUO); el percentatge global de partit va ser del 96,3%. La força de l'acord també va ser determinada pel valor Kappa de Cohen, que era de 0,925, cosa que indica un acord total amb el CRS. De nou, els nostres resultats són idèntics als estudis realitzats a la Universitat Central del Sud a Changsha, Xina, i al Departament de Laboratori Clínic de l'Hospital Popular de Liuzhou, a la ciutat de Liuzhou, Xina17. Tot i que es va registrar la bona concordança estadística anterior, la prova de chi quadrat (test MacNemar) va mostrar que el resultat de l'assaig Sansure Biotech ha tingut una diferència estadísticament significativa en comparació amb el CRS (p <0,005). Tot i que es va registrar la bona concordança estadística anterior, la prova de chi quadrat (test MacNemar) va mostrar que el resultat de l'assaig Sansure Biotech ha tingut una diferència estadísticament significativa en comparació amb el CRS (p <0,005). Несмотря на то, что было зафиксировано указанное выше хорошее статистическое сототировано указанное выше хорошее статистическое сототировано хи-квадрат (критерий Макнемара) показал, что результат анализа Sansure Biotech имеет статистичесри злесери злеска зализа по сравнению с CRS (p <0,005). Tot i que es va registrar el bon acord estadístic anterior, la prova de chi quadrat (test McNemar) va mostrar que el resultat de l'assaig Sansure Biotech tenia una diferència estadísticament significativa en comparació amb el CRS (p < 0,005).尽管记录了上述良好的统计一致性，但卡方检验（MacNemar 检验）表明，但卡方检验（MacNemar 检验）表明，但卡方检验）表明，但卡方检暵暞暗暞暗相比具有统计学显着差异（p < 0,005）.尽管 记录 了 上述 良好 统计 一致性 ， 但 检验 （（macnemar 检验 表明 ， biotech ， 检验 ，与 crs 相比 具有 显着 （（p <0,005。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。＼。。）） Несмотря на отмеченное выше хорошее статистическое соответствие, критерий хи-квадрат (критерий хи-квадратрат) (критерий хи-квадратрат) показал статистически значимую разницу (p < 0,005) между анализом Sansure Biotech i CRS. Malgrat el bon acord estadístic assenyalat anteriorment, la prova de chi quadrat (test McNemar) va mostrar una diferència estadísticament significativa (p <0,005) entre l'assaig Sansure Biotech i el CRS.Es va trobar que sis mostres (3,66%) eren falsos negatius en comparació amb CRS (taula suplementària 1); això és molt important, sobretot tenint en compte la dinàmica de transmissió del virus. Les dades anteriors també admeten aquesta baixa taxa de detecció15.
En aquest estudi, es van determinar els valors de Ct per a cada assaig i plataforma respectiva, amb el valor Ct mitjà més baix reportat a l'assaig Abbott SARS-CoV-2. Aquest resultat pot estar relacionat amb el sistema de proves genètiques combinades simultànies d'Abbott per a la detecció de SARS-CoV-2. Per tant, segons la figura 1, el 87,6% dels resultats d'Abbott SARS-CoV-2 tenien valors Ct inferiors a 20. Només un petit nombre de resultats de mostra (12,4%) es trobaven en el rang 20-30. No es van registrar valors de Ct superiors a 30. A més de l'ús que fa Abbott del format de prova genètica del panell SARS-CoV-2, aquest resultat pot estar relacionat amb el límit de detecció inferior (32,5 còpies d'ARN/ml)18, que és tres vegades inferior al límit inferior de 100 còpies d'ARN de l'empresa. /mL. ml)19.
Aquest estudi té algunes limitacions: en primer lloc, no disposem de mètodes estàndard/de referència [com ara la càrrega viral o altres proves de laboratori (LDA)] per manca de recursos. En segon lloc, tots els exemplars utilitzats en aquest estudi eren hisops nasofaríngs, mentre que els resultats no eren aplicables a altres tipus d'exemplars i, en tercer lloc, la nostra mida de mostra era petita.
Aquest estudi va comparar el rendiment de quatre assajos rRT-PCR per a SARS-CoV-2 mitjançant mostres nasofaríngies. Tots els assajos de detecció van tenir un rendiment gairebé comparable, a excepció de l'assaig Sansure Biotech. A més, es va identificar la baixa taxa de positivitat en l'assaig Sansure Biotech en comparació amb el CRS (p <0,05). A més, es va identificar la baixa taxa de positivitat en l'assaig Sansure Biotech en comparació amb el CRS (p <0,05). Кроме того, в тесте Sansure Biotech был выявлен низкий процент положительных результатов по срав нсне5 (CRS, CRS5). A més, la prova Sansure Biotech va mostrar un baix percentatge de resultats positius en comparació amb CRS (p < 0,05).此外，与CRS 相比，Sansure Biotech 检测的阳性率较低(p <0,05)。此外，与CRS 相比，Sansure Biotech 检测的阳性率较低(p <0,05)。 Кроме того, анализ Sansure Biotech имел более низкий уровень положительных результатов по сравен, CRS5 (CRS5). A més, l'assaig Sansure Biotech va tenir una taxa de positivitat més baixa en comparació amb CRS (p <0,05).L'anàlisi de Sansure Biotech nCoV-2019 (RUO) de PPA, NPA i acord global va superar el 93,5% amb un valor d'acord de Cohen Kappa de 0,925. Finalment, el Sansure Biotech Assay (RUO) necessita una validació addicional per utilitzar-lo a Etiòpia, i s'hauria de considerar investigacions addicionals per avaluar les afirmacions dels fabricants individuals.
El disseny d'estudi comparatiu es va dur a terme a quatre centres sanitaris d'Addis Abeba, l'Hospital Eka Kotebe, el Centre de tractament de l'Església del Mil·lenni, l'Hospital Memorial Zewooditu i l'Hospital Especialitzat en Tuberculosi de Sant Pere. Les dades es van recollir entre l'1 i el 31 de desembre de 2020. Les instal·lacions mèdiques per a aquest estudi es van escollir intencionadament en funció del seu gran nombre de casos i de la disponibilitat dels principals centres de tractament a la ciutat. De la mateixa manera, es van seleccionar instruments, inclosos els instruments de PCR en temps real ABI 7500 i Abbott m2000, d'acord amb les recomanacions dels fabricants de reactius NAAT, i es van seleccionar quatre kits de detecció de PCR per a aquest estudi, ja que la majoria dels laboratoris d'Etiòpia van utilitzar almenys almenys. quatre d'ells. Prova gènica, prova Abbott SARS-CoV-2, prova Sansure Biotech i prova SARS-CoV-2 BGI realitzada durant l'estudi).
Les proves de SARS-CoV-2 es van realitzar de l'1 al 30 de desembre de 2020 amb 3 ml de Viral Transport Medium (VTM) (Miraclean Technology, Shenzhen, Xina) d'individus investigats per COVID-19 referits a EPHI. Les mostres nasofaríngies van ser recollides per recollidors de mostres entrenats i enviades a EPHI en paquets triples. Abans de l'aïllament de l'àcid nucleic, a cada mostra se li assigna un número d'identificació únic. L'extracció es realitza de cada mostra immediatament a l'arribada mitjançant mètodes d'extracció manuals i automàtics. Així, per a l'extracció automàtica d'Abbott m2000, es van extreure 1,3 ml (incloent 0,8 ml de volum mort i 0,5 ml de volum d'entrada d'extracció) de la mostra de cada mostra i es va passar pel sistema de preparació de mostres d'ADN Abbott (Abbott Molecular Inc. des Plaines, IL, EUA). ) Es va incloure un lot de 96 [92 mostres, dos controls de detecció i dos controls sense plantilla (NTC)] en el procés global (recuperació i detecció) de dues rondes de SARS-CoV-2 (EUA) en temps real. mineria. De la mateixa manera, per a l'extracció manual, utilitzeu les mateixes mostres (per a l'extracció i descobriment automàtic). Així, durant tot el procés, es van dividir en alíquotes de 140 µl de mostres i es van extreure mitjançant el QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Alemanya) en lots de 24 (incloent 20 mostres, dos controls d'assaig i dos NTC) durant nou rondes. Els eluats extrets manualment es van amplificar i detectar mitjançant un termociclador ABI 7500 mitjançant un assaig SARS-CoV-2 BGI, un assaig Daan Gene i un assaig Sansure Biotech.
L'aïllament i la purificació automatitzats de l'ARN viral SARS-CoV-2 segueix el principi de les perles magnètiques mitjançant reactius de preparació de mostres d'ADN d'Abbott. La inactivació de les mostres i la solubilització de partícules virals es duu a terme mitjançant un detergent que conté isotiocianat de guanidina per desnaturalitzar la proteïna i inactivar la RNasa. Després, l'ARN es separa de la proteïna mitjançant la separació en fase sòlida utilitzant sílice, és a dir, la sal de guanidini i el pH alcalí del tampó de lisi afavoreixen la unió dels àcids nucleics a la sílice (SiO2). L'etapa d'esbandida elimina les proteïnes restants i els residus per produir una solució clara. L'ARN transparent s'aïlla de micropartícules basades en sílice mitjançant el camp magnètic de l'instrument20,21. D'altra banda, l'aïllament manual i la purificació de l'ARN es duu a terme pel mètode de la columna de spin mitjançant la centrifugació en lloc d'un suport magnètic i la separació de micropartícules de l'eluent.
La prova de detecció de SARS-CoV-2 en temps real d'Abbott (Abbott Molecular, Inc.) es va realitzar segons les instruccions del fabricant, que va rebre EUA19,22 de l'OMS i la FDA. En aquest protocol, la inactivació de la mostra abans de l'extracció es va realitzar en un bany maria a 56 ° C durant 30 min. Després de la inactivació del virus, es va realitzar l'extracció d'àcid nucleic en un instrument Abbott m2000 SP a partir de 0,5 ml de VTM mitjançant un sistema de preparació de mostres d'ADN Abbott m2000. segons el fabricant. L'amplificació i la detecció es van realitzar mitjançant un instrument RT-PCR Abbott m2000 i es va realitzar una detecció dual per als gens RdRp i N. ROX) i VIC P (colorant propi) per a l'orientació i detecció de controls interns, permetent la detecció simultània d'ambdós productes d'amplificació 19 .
El mètode de detecció d'amplificació d'aquest kit es basa en la tecnologia RT-PCR d'un sol pas. Els gens ORF1a/b i N van ser seleccionats com a regions conservades per Daan Gene Technology per detectar l'amplificació de la regió objectiu. S'han dissenyat cebadors específics i sondes fluorescents (sondes del gen N marcades amb FAM, sondes ORF1a/b marcades amb VIC) per detectar l'ARN del SARS-CoV-2 a les mostres. L'eluent final i les mescles mestres es van preparar afegint 5 µl d'eluent a 20 µl de la mescla mestra a un volum final de 25 µl. L'amplificació i la detecció es van realitzar simultàniament en un instrument de PCR en temps real ABI 750024.
Els gens ORF1a/b i N es van detectar mitjançant el kit de diagnòstic d'àcids nucleics Sansure Biotech nCoV-2019 (detecció de PCR fluorescent). Prepareu sondes específiques per a cada gen objectiu seleccionant el canal FAM per a la regió ORF1a/b i el canal ROX per al gen N. A aquest kit d'assaig, s'afegeixen reactius d'eluint i mescla mestra de la següent manera: prepareu 30 µl de reactiu de mescla mestra i 20 µl de mostra eluïda per a la detecció/amplificació. Es va utilitzar PCR en temps real ABI 750025 per a l'amplificació/detecció.
La prova SARS-CoV-2 BGI és un kit fluorescent de rRT-PCR en temps real per al diagnòstic de COVID-19. La regió objectiu es troba a la regió ORF1a/b del genoma SARS-CoV-2, que és un mètode de detecció d'un sol gen. A més, el gen humà β-actina és un gen objectiu regulat internament. La mescla mestra es prepara barrejant 20 µl del reactiu de la mescla mestra i 10 µl de la mostra d'ARN extreta en una placa de pou26. Es va utilitzar un instrument de PCR quantitatiu fluorescent en temps real ABI 7500 per a l'amplificació i la detecció. Tota l'amplificació d'àcids nucleics, les condicions d'execució de la PCR per a cada assaig i la interpretació dels resultats es van realitzar segons les instruccions del fabricant respectiu (taula 3).
En aquesta anàlisi comparativa, no hem utilitzat el mètode estàndard de referència per determinar el percentatge d'acord (positiu, negatiu i global) i altres paràmetres de comparació per a les quatre anàlisis. Cada comparació de prova es va fer amb CRS, en aquest estudi el CRS es va establir per la regla "qualsevol positiu" i el resultat es va determinar, no per una sola prova, vam utilitzar almenys dos resultats de la prova coincidents. A més, en el cas de la transmissió de la COVID-19, els resultats falsos negatius són més perillosos que els falsos positius. Per tant, per dir "positiu" amb la màxima precisió possible a partir d'un resultat CRS, almenys dues proves d'assaig han de ser positives, el que significa que és probable que almenys un resultat positiu provingui d'un assaig EUA. Així, de quatre resultats de la prova, dos o més resultats de la prova que donen el mateix resultat es consideren veritables positius o negatius18,27.
Les dades es van recollir mitjançant formularis d'extracció de dades estructurades, l'entrada i l'anàlisi de dades es van realitzar mitjançant el programari estadístic Excel i SPSS versió 23.0 per a estadístiques descriptives. Es va analitzar el percentatge d'acord positiu, negatiu i global i es va utilitzar una puntuació Kappa per determinar el grau d'acord de cada mètode amb CRS. Els valors Kappa s'interpreten de la següent manera: 0,01 a 0,20 per a acord lleu, 0,21 a 0,40 per acord general, 0,41-0,60 per acord moderat, 0,61-0,80 per acord major i 0,81-0,99 per acord complet28.
Es va obtenir l'autorització ètica de la Universitat d'Addis Abeba i tots els protocols experimentals per a aquest estudi van ser aprovats per la Junta de Revisió Científica de l'Institut de Salut Pública d'Ethiopian. El número de referència per a la llicència d'ètica EPHI és EPHI/IRB-279-2020. Tots els mètodes es van aplicar d'acord amb les recomanacions i disposicions de les Directrius nacionals integrals d'Etiòpia per al tractament de la COVID-19. A més, es va obtenir el consentiment informat per escrit de tots els participants de l'estudi abans de participar en l'estudi.
Totes les dades obtingudes o analitzades en aquest estudi s'inclouen en aquest article publicat. Les dades que donen suport als resultats d'aquest estudi estan disponibles de l'autor respectiu a petició raonable.
Organització Mundial de la Salut. Recomanacions per a les estratègies de proves de laboratori per a la COVID-19: orientació provisional, 21 de març de 2020 núm. WHO/2019-nCoV/lab_testing/2020.1 (OMS, 2020).
Mouliou, DS, Pantazopoulos, I. & Gourgoulianis, KI Diagnòstic intel·ligent COVID-19 al departament d'urgències: tot en la pràctica. Mouliou, DS, Pantazopoulos, I. & Gourgoulianis, KI Diagnòstic intel·ligent COVID-19 al departament d'urgències: tot en la pràctica.Muliou, DS, Pantazopoulos, I. i Gurgulianis, KI Diagnòstic intel·ligent de COVID-19 al servei d'urgències: tot a la pràctica.Muliou DS, Pantazopoulos I. i Gurgulyanis KI Diagnòstic intel·ligent de COVID-19 als serveis d'urgències: integració d'extrem a extrem a la pràctica. Expert Reverend Respire. medicament. 3, 263–272 (2022).
Mitchell, SL i St George, K. Evaluation of the COVID19 ID NOW EUA assay. Mitchell, SL i St George, K. Evaluation of the COVID19 ID NOW EUA assay.Mitchell, SL i St. George, K. Evaluation of the COVID19 ID NOW EUA assay.Mitchell SL i St. George K. Avaluació de l'assaig COVID19 ID NOW EUA. J. Clínica. Virus. 128, 104429. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104429 (2020).
OMS. Detecció de laboratori de la malaltia coronavirus 2019 (COVID-19) en sospita de malaltia humana. https://www.who.int/publications/i/item/10665-331501 (consultat el 15 d'agost de 2020) (OMS, 2020).
Udugama, B. et al. Diagnòstic de la COVID-19: malalties i eines de prova. ACS Nano 14(4), 3822–3835 (2020).
Syed S. et al. Establiment del Col·legi de Patòlegs d'Àfrica Oriental, Central i Austral - Escola Regional de Patologia de l'Orient Mitjà i Sud-àfrica. Àfrica. J. Lab. medicament. 9(1), 1-8 (2020).
Institut Etíop de Salut Pública, Ministeri Federal de Salut. Estratègia nacional provisional i orientació per al diagnòstic de laboratori de la COVID-19. https://ephi.gov.et/images/novel_coronavirus/EPHI_PHEOC_COVID-19_Laboratory_Diagnosis_Eng.pdf (consultat el 12 d'agost de 2020) (EPHI, 2020).
Woloshin, S., Patel, N. i Kesselheim, AS Proves falses negatives per als reptes i implicacions de la infecció per SARS-CoV-2. Woloshin, S., Patel, N. i Kesselheim, AS Proves falses negatives per als reptes i implicacions de la infecció per SARS-CoV-2.Voloshin S., Patel N. i Kesselheim AS Proves fals negatives per a les infeccions per SARS-CoV-2 i les seves conseqüències.Voloshin S., Patel N. i Kesselheim AS Proves fals-negatives per a la provocació i l'impacte de la infecció per SARS-CoV-2. N. eng. J. Medicina. 383(6), e38 (2020).
Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI Casos falsos positius i falsos negatius de la COVID-19: estratègies de prevenció i gestió respiratòries, vacunació i altres perspectives. Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI Casos falsos positius i falsos negatius de la COVID-19: estratègies de prevenció i gestió respiratòries, vacunació i altres perspectives. Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI Ложноположительные и ложноотрицательные случаи COVID-19: респираторная проспигительные прострицательные случаи лечения, вакцинация i дальнейшие перспективы. Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI Casos falsos positius i falsos negatius de COVID-19: estratègies de prevenció i tractament respiratori, vacunació i camí a seguir.Muliu, DS i Gurgulianis, KI Casos falsos positius i falsos negatius de COVID-19: estratègies de prevenció i tractament respiratori, vacunació i camí a seguir. Expert Reverend Respire. medicament. 15(8), 993–1002 (2021).
Mouliou, DS, Ioannis, P. & Konstantinos, G. Diagnòstic de COVID-19 al servei d'urgències: veure l'arbre però perdre el bosc. Mouliou, DS, Ioannis, P. & Konstantinos, G. Diagnòstic de COVID-19 al servei d'urgències: veure l'arbre però perdre el bosc.Mouliou, DS, Ioannis, P. i Konstantinos, G. Diagnòstic COVID-19 al departament d'emergències: veure l'arbre, perdre el bosc.Muliou DS, Ioannis P. i Konstantinos G. Diagnòstic de la COVID-19 a les sales d'emergència: no hi ha prou bosc per als arbres. Apareix. medicament. J. https://doi.org/10.1136/emermed-2021-212219 (2022).
Degli-Angeli, E. et al. Validació i validació del rendiment analític i clínic de l'assaig Abbott RealTime SARS-CoV-2. J. Clínica. Virus. 129, 104474. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104474 (2020).
Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. i Aflatoonian, B. Comparació de cinc conjunts d'imprimacions de diferents regions del genoma de COVID-19 per a la detecció d'infeccions per virus mitjançant RT-PCR convencional. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. i Aflatoonian, B. Comparació de cinc conjunts d'imprimacions de diferents regions del genoma de COVID-19 per a la detecció d'infeccions per virus mitjançant RT-PCR convencional.Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. i Aflatunyan, B. Comparació de cinc conjunts d'encebadors de diferents regions del genoma COVID-19 per a la detecció d'infeccions virals mitjançant RT-PCR convencional. Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. i Aflatoonian, B. 比较来自COVID-19不同基因组区域的五个引物组，用于通过常规RT-PCR 检测病毒感染。 Mollaei, HR, Afshar, AA, Kalantar-Neyestanaki, D., Fazlalipour, M. i Aflatoonian, B. Comparació de 5 regions genètiques diferents de COVID-19 per a la detecció d'infecció viral mitjançant RT-PCR convencional.Mollaei HR, Afshar AA, Kalantar-Neyestanaki D, Fazlalipour M. i Aflatunyan B. Comparació de cinc conjunts d'encebadors de diferents regions del genoma COVID-19 per a la detecció d'infeccions virals mitjançant RT-PCR convencional.Iran. J. Microbiologia. 12(3), 185 (2020).
Goertzer, I. et al. Resultats preliminars del programa nacional d'avaluació de la qualitat externa per a la detecció de seqüències del genoma SARS-CoV-2. J. Clínica. Virus. 129, 104537. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104537 (2020).
Wang, M. et al. Avaluació analítica de l'eficàcia de cinc kits de RT-PCR per a la síndrome respiratòria aguda severa Coronavirus 2. J. Clinical. laboratori. anus. 35(1), e23643 (2021).
Wang B. et al. Avaluació de set kits de detecció d'ARN SARS-CoV-2 disponibles comercialment a la Xina basats en la reacció en cadena de la polimerasa (PCR) en temps real. clínica. Química. laboratori. medicament. 58(9), e149–e153 (2020).
van Casteren, PB et al. Comparació de set kits comercials de diagnòstic RT-PCR COVID-19. J. Clínica. Virus. 128, 104412 (2020).
Lu, Yu, et al. Comparació del rendiment diagnòstic de dos kits de PCR per a la detecció d'àcids nucleics SARS-CoV-2. J. Clínica. laboratori. anus. 34(10), e23554 (2020).
Lefart, PR, etc. Un estudi comparatiu de quatre plataformes de proves d'amplificació d'àcids nucleics (NAAT) SARS-CoV-2 va mostrar que el rendiment d'ID NOW es va degradar significativament segons el pacient i el tipus de mostra. diagnòstic. microbiologia. Infectar. diss. 99(1), 115200 (2021).
Molècula d'Abbott. Insert del paquet d'anàlisi del SARS-CoV-2 d'Abbott en temps real. https://www.molecular.abbott/us/en/products/infectious-disease/RealTime-SARS-CoV-2-Assay. 1-12. (A partir del 10 d'agost de 2020) (2020).
Klein, S. et al. Aïllament de l'ARN SARS-CoV-2 mitjançant perles magnètiques per a una detecció ràpida a gran escala mitjançant RT-qPCR i RT-LAMP. Virus 12(8), 863 (2020).