Factors d'interferència en les reaccions de PCR

Durant la reacció de PCR, sovint es troben alguns factors interferents.
A causa de l'alta sensibilitat de la PCR, la contaminació es considera un dels factors més importants que afecten els resultats de la PCR i pot produir resultats falsos positius.
Igualment importants són les diverses fonts que donen lloc a resultats falsos negatius. Si una o més parts essencials de la mescla de PCR o de la mateixa reacció d'amplificació s'inhibeixen o s'interfereixen amb ella, l'assaig de diagnòstic es pot veure obstaculitzat. Això pot conduir a una reducció de l'eficiència i fins i tot a resultats falsos negatius.
A més de la inhibició, es pot produir una pèrdua d'integritat de l'àcid nucleic diana a causa de les condicions d'enviament i/o emmagatzematge abans de la preparació de la mostra. En particular, les altes temperatures o un emmagatzematge inadequat poden provocar danys a les cèl·lules i els àcids nucleics. La fixació de cèl·lules i teixits i la inclusió en parafina són causes ben conegudes de fragmentació de l'ADN i un problema persistent (vegeu les figures 1 i 2). En aquests casos, ni tan sols un aïllament i una purificació òptims ajudaran.

Figura 1 | Efecte de la immobilització sobre la integritat de l'ADN
L'electroforesi en gel d'agarosa va mostrar que la qualitat de l'ADN aïllat de seccions de parafina d'autòpsies variava considerablement. En els extractes hi havia ADN de diferents longituds mitjanes de fragments presents depenent del mètode de fixació. L'ADN només es va conservar quan es va fixar en mostres natives congelades i en formalina neutra tamponada. L'ús d'un fixador de Bouin fortament àcid o de formalina sense tamponar que conté àcid fòrmic va provocar una pèrdua significativa d'ADN. La fracció restant està altament fragmentada.
A l'esquerra, la longitud dels fragments s'expressa en parells de quilobases (kbp)

Figura 2 | Pèrdua d'integritat de les dianes d'àcid nucleic
(a) Un espai de 3′-5′ en ambdues cadenes provocarà una ruptura en l'ADN diana. La síntesi d'ADN encara es produirà en el fragment petit. Tanmateix, si falta un lloc d'hibridació del primer al fragment d'ADN, només es produeix una amplificació lineal. En el cas més favorable, els fragments es poden resaturar entre si, però els rendiments seran petits i per sota dels nivells de detecció.
(b) La pèrdua de bases, principalment a causa de la despurinació i la formació de dímers de timidina, condueix a una disminució del nombre d'enllaços d'H i una disminució de la Tm. Durant la fase d'escalfament allargada, els encebadors es fondran de l'ADN matricial i no es recuitan ni tan sols en condicions menys estrictes.
(c) Les bases de timina adjacents formen un dímer TT.
Un altre problema comú que sovint es produeix en el diagnòstic molecular és l'alliberament no òptim dels àcids nucleics diana en comparació amb l'extracció amb fenol-cloroform. En casos extrems, això pot estar associat a falsos negatius. Es pot estalviar molt de temps mitjançant la lisi per ebullició o la digestió enzimàtica de les restes cel·lulars, però aquest mètode sovint resulta en una baixa sensibilitat de la PCR a causa d'una alliberament insuficient d'àcids nucleics.

Inhibició de l'activitat de la polimerasa durant l'amplificació

En general, la inhibició s'utilitza com a concepte contenidor per descriure tots els factors que condueixen a resultats de PCR subòptims. En un sentit estrictament bioquímic, la inhibició es limita a l'activitat de l'enzim, és a dir, redueix o impedeix la conversió substrat-producte mitjançant la interacció amb el centre actiu de l'ADN polimerasa o el seu cofactor (per exemple, Mg2+ per a la Taq ADN polimerasa).
Els components de la mostra o diversos tampons i extractes que contenen reactius poden inhibir directament l'enzim o atrapar els seus cofactors (per exemple, EDTA), inactivant així la polimerasa i, al seu torn, provocant resultats de PCR disminuïts o falsos negatius.
Tanmateix, moltes interaccions entre els components de la reacció i els àcids nucleics que contenen la diana també es denominen "inhibidors de la PCR". Un cop la integritat de la cèl·lula s'interromp per l'aïllament i s'allibera l'àcid nucleic, es poden produir interaccions entre la mostra i la solució circumdant i la fase sòlida. Per exemple, els "eliminadors" poden unir-se a l'ADN monocatenari o bicatenari mitjançant interaccions no covalents i interferir amb l'aïllament i la purificació reduint el nombre de dianes que finalment arriben al recipient de reacció de la PCR.
En general, els inhibidors de la PCR són presents en la majoria de fluids corporals i reactius utilitzats per a proves de diagnòstic clínic (urea a l'orina, hemoglobina i heparina a la sang), suplements dietètics (components orgànics, glicogen, greixos, ions Ca2+) i components del medi ambient (fenols, metalls pesants).

Els inhibidors de la PCR més prevalents es poden trobar en bacteris i cèl·lules eucariotes, ADN no diana, macromolècules d'unió a l'ADN de matrius tissulars i equips de laboratori com ara guants i plàstics. La purificació dels àcids nucleics durant o després de l'extracció és el mètode preferit per eliminar els inhibidors de la PCR.
Avui dia, diversos equips d'extracció automatitzats poden substituir molts protocols manuals, però mai s'ha aconseguit una recuperació i/o purificació del 100% de les dianes. Els inhibidors potencials encara poden ser presents en els àcids nucleics purificats o ja poden haver fet efecte. Existeixen diferents estratègies per reduir l'impacte dels inhibidors. L'elecció de la polimerasa adequada pot tenir un impacte significatiu en l'activitat inhibidora. Altres mètodes provats per reduir la inhibició de la PCR són augmentar la concentració de polimerasa o aplicar additius com la BSA.
La inhibició de les reaccions de PCR es pot demostrar mitjançant l'ús del control de qualitat del procés intern (IPC).
Cal anar amb compte d'eliminar tots els reactius i altres solucions del kit d'extracció, com ara etanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol i fenol, de l'aïllat d'àcid nucleic mitjançant un rentat complet. Depenent de la seva concentració, poden activar o inhibir la PCR.