Factors d’interferència en les reaccions de PCR

Durant la reacció de PCR, sovint es troben alguns factors interferents.
A causa de la molt alta sensibilitat de la PCR, es considera que la contaminació és un dels factors més importants que afecten els resultats de la PCR i pot produir resultats positius falsos.
Igualment crítics són les diverses fonts que condueixen a resultats falsos-negatius. Si s’inhibeixen o interfereixen una o més parts essencials de la barreja de PCR o la reacció d’amplificació en si, es pot dificultar l’assaig diagnòstic. Això pot comportar una eficiència reduïda i fins i tot falsos resultats negatius.
A més de la inhibició, es pot produir una pèrdua de la integritat de l’àcid nucleic objectiu a causa de les condicions d’enviament i/o d’emmagatzematge abans de la preparació de la mostra. En particular, les temperatures elevades o l’emmagatzematge inadequat poden provocar danys de cèl·lules i àcids nucleics. La fixació de les cèl·lules i els teixits i l’incrustació de parafina són causes conegudes de fragmentació d’ADN i un problema persistent (vegeu les figures 1 i 2). En aquests casos, fins i tot l’aïllament i la purificació òptims no ajudaran.

Figura 1 | Efecte de la immobilització en la integritat de l'ADN
L’electroforesi en gel d’agarosa va demostrar que la qualitat de l’ADN aïllat de les seccions de parafina d’autòpsies variava considerablement. L’ADN de diferents longituds mitjanes del fragment estava present en els extractes en funció del mètode de fixació. L’ADN només es va conservar quan es va fixar en mostres congelades natives i en formalina neutra tamponada. L’ús d’una formalina fixadora de bouina fortament àcida o sense embussar-se amb una pèrdua significativa d’ADN. La fracció restant està molt fragmentada.
A l'esquerra, la longitud dels fragments s'expressa en parells de quilobase (KBP)

Figura 2 | Pèrdua d’integritat d’objectius d’àcid nucleic
(a) Una bretxa de 3'-5 ′ a les dues cadenes donarà lloc a una ruptura en l'ADN objectiu. La síntesi de l'ADN encara es produirà al petit fragment. Tanmateix, si falta un lloc de recobriment d’imprimació al fragment d’ADN, només es produeix una amplificació lineal. En el cas més favorable, els fragments es poden tornar a resaturar, però els rendiments seran petits i per sota dels nivells de detecció.
(B) La pèrdua de bases, principalment a causa de la despurinació i la formació del dímer de timidina, condueix a una disminució del nombre de bons H i a una disminució de la TM. Durant la fase d’escalfament allargat, els imprimadors es fonran de l’ADN de la matriu i no es recomana ni tan sols en condicions menys estrictes.
(c) Les bases de timina adjacents formen un dímer TT.
Un altre problema comú que sovint es produeix en diagnòstics moleculars és l’alliberament menys que òptim d’àcids nucleics objectiu en comparació amb l’extracció de fenol-cloroform. En casos extrems, això es pot associar a falsos negatius. Es pot estalviar molt de temps mitjançant la lisi bullent o la digestió enzimàtica de les deixalles cel·lulars, però aquest mètode sovint produeix una baixa sensibilitat a PCR a causa de l’alliberament d’àcid nucleic insuficient.

Inhibició de l'activitat de la polimerasa durant l'amplificació

En general, la inhibició s’utilitza com a concepte de contenidor per descriure tots els factors que condueixen a resultats de PCR subòptims. En un sentit estrictament bioquímic, la inhibició es limita a l’activitat de l’enzim, és a dir, redueix o impedeix la conversió del producte de substrat mitjançant la interacció amb el lloc actiu de la polimerasa d’ADN o el seu cofactor (per exemple, MG2+ per a l’ADN polimerasa TAQ).
Els components de la mostra o diversos tampons i extractes que contenen reactius poden inhibir directament l’enzim o atrapar els seus cofactors (per exemple EDTA), inactivant així la polimerasa i, al seu torn, donant a disminuir o falsos resultats de PCR negatius.
Tot i això, moltes interaccions entre components de reacció i àcids nucleics que contenen objectiu també es designen com a "inhibidors de la PCR". Una vegada que la integritat de la cèl·lula es veu alterada per l’aïllament i s’allibera l’àcid nucleic, es poden produir interaccions entre la mostra i la seva solució circumdant i la seva fase sòlida. Per exemple, els "scavengers" poden unir l'ADN d'una sola o doble cadena mitjançant interaccions no covalents i interferir amb l'aïllament i la purificació reduint el nombre d'objectius que eventualment arriben al recipient de reacció PCR.
En general, els inhibidors de la PCR estan presents a la majoria de líquids i reactius del cos utilitzats per a proves de diagnòstic clínic (urea en orina, hemoglobina i heparina en sang), suplements dietètics (components orgànics, glicogen, greix, ions Ca2+) i components del medi (fenols, metalls pesants)

Es poden trobar inhibidors de PCR més freqüents en bacteris i cèl·lules eucariotes, ADN no objectiu, macromolècules que uneixen l'ADN de matrius de teixit i equips de laboratori com guants i plàstics. La purificació d’àcids nucleics durant o després de l’extracció és el mètode preferit per eliminar els inhibidors de la PCR.
Avui en dia, diversos equips d’extracció automatitzats poden substituir molts protocols manuals, però no s’ha aconseguit mai el 100% de recuperació i/o purificació d’objectius. Els inhibidors potencials encara poden estar presents en els àcids nucleics purificats o poden haver tingut efecte. Existeixen diferents estratègies per reduir l’impacte dels inhibidors. L’elecció de la polimerasa adequada pot tenir un impacte significatiu en l’activitat dels inhibidors. Altres mètodes provats per reduir la inhibició de la PCR són augmentar la concentració de polimerasa o aplicar additius com BSA.
La inhibició de les reaccions de PCR es pot demostrar mitjançant l’ús del control de qualitat del procés intern (IPC).
S’ha de tenir cura d’eliminar tots els reactius i altres solucions del kit d’extracció, com l’etanol, EDTA, CETAB, LiCL, Guscn, SDS, isopropanol i fenol, de l’aïllat d’àcid nucleic mitjançant un pas complet de rentat. Segons la seva concentració, poden activar o inhibir la PCR.