Factors d'interferència en les reaccions de PCR

Durant la reacció de PCR, sovint es troben alguns factors interferents.
A causa de la sensibilitat molt alta de la PCR, la contaminació es considera un dels factors més importants que afecten els resultats de la PCR i pot produir resultats falsos positius.
Igualment crítiques són les diverses fonts que condueixen a resultats falsos negatius.Si una o més parts essencials de la barreja de PCR o la pròpia reacció d'amplificació s'inhibeixen o interfereixen, es pot dificultar l'assaig diagnòstic.Això pot provocar una reducció de l'eficiència i fins i tot resultats falsos negatius.
A més de la inhibició, es pot produir una pèrdua de la integritat de l'àcid nucleic objectiu a causa de les condicions d'enviament i/o emmagatzematge abans de la preparació de la mostra.En particular, les altes temperatures o l'emmagatzematge inadequat poden provocar danys a les cèl·lules i els àcids nucleics.La fixació de cèl·lules i teixits i la incrustació de parafina són causes ben conegudes de la fragmentació de l'ADN i un problema persistent (vegeu les figures 1 i 2).En aquests casos, fins i tot l'aïllament i la purificació òptims no ajudaran.

Figura 1 |Efecte de la immobilització sobre la integritat de l'ADN
L'electroforesi en gel d'agarosa va demostrar que la qualitat de l'ADN aïllat de les seccions de parafina d'autòpsies variava considerablement.En els extractes hi havia ADN de diferents longituds mitjanes de fragments en funció del mètode de fixació.L'ADN es va conservar només quan es va fixar en mostres congelades natives i en formalina neutra tamponada.L'ús d'un fixador Bouin fortament àcid o formalina que conté àcid fòrmic sense tamponar va provocar una pèrdua important d'ADN.La fracció restant està molt fragmentada.
A l'esquerra, la longitud dels fragments s'expressa en parells de quilobases (kbp)

Figura 2 |Pèrdua d'integritat de les dianes d'àcid nucleic
(a) Un buit de 3'-5' a les dues cadenes donarà lloc a una ruptura de l'ADN objectiu.la síntesi d'ADN encara es produirà al fragment petit.Tanmateix, si falta un lloc de recuit del primer al fragment d'ADN, només es produeix l'amplificació lineal.En el cas més favorable, els fragments es poden resaturar entre si, però els rendiments seran petits i per sota dels nivells de detecció.
(b) La pèrdua de bases, principalment a causa de la depurinació i la formació de dímers de timidina, comporta una disminució del nombre d'enllaços H i una disminució de la Tm.Durant la fase d'escalfament allargada, els cebadors es fondran lluny de l'ADN de la matriu i no s'aniran recuit fins i tot en condicions menys estrictes.
( c ) Les bases de timina adjacents formen un dímer TT.
Un altre problema comú que es produeix sovint en el diagnòstic molecular és l'alliberament menys que òptim d'àcids nucleics diana en comparació amb l'extracció de fenol-cloroform.En casos extrems, això pot estar associat a falsos negatius.Es pot estalviar molt de temps mitjançant la lisi en ebullició o la digestió enzimàtica de les restes cel·lulars, però aquest mètode sovint provoca una baixa sensibilitat a la PCR a causa de l'alliberament insuficient d'àcid nucleic.

Inhibició de l'activitat de la polimerasa durant l'amplificació

En general, la inhibició s'utilitza com a concepte de contenidor per descriure tots els factors que condueixen a resultats de PCR subòptims.En un sentit estrictament bioquímic, la inhibició es limita a l'activitat de l'enzim, és a dir, redueix o impedeix la conversió de substrat-producte mitjançant la interacció amb el lloc actiu de l'ADN polimerasa o el seu cofactor (per exemple, Mg2+ per a l'ADN polimerasa Taq).
Els components de la mostra o diversos tampons i extractes que contenen reactius poden inhibir directament l'enzim o atrapar els seus cofactors (per exemple, EDTA), inactivant així la polimerasa i, al seu torn, conduint a resultats de PCR fals o negatius.
Tanmateix, moltes interaccions entre components de la reacció i àcids nucleics que contenen diana també es designen com a "inhibidors de la PCR".Una vegada que la integritat de la cèl·lula es veu alterada per l'aïllament i s'allibera l'àcid nucleic, es poden produir interaccions entre la mostra i la seva solució circumdant i la fase sòlida.Per exemple, els "cavengers" poden unir ADN monocatenari o doble a través d'interaccions no covalents i interferir amb l'aïllament i la purificació reduint el nombre d'objectius que finalment arriben al recipient de reacció de la PCR.
En general, els inhibidors de la PCR estan presents a la majoria de fluids corporals i reactius utilitzats per a proves de diagnòstic clínic (urea a l'orina, hemoglobina i heparina a la sang), suplements dietètics (components orgànics, glicogen, greix, ions Ca2+) i components del medi ambient (fenols). , metalls pesants)

Es poden trobar inhibidors de PCR més freqüents en bacteris i cèl·lules eucariotes, ADN no objectiu, macromolècules d'unió a l'ADN de matrius de teixits i equips de laboratori com ara guants i plàstics.La purificació dels àcids nucleics durant o després de l'extracció és el mètode preferit per eliminar els inhibidors de la PCR.
Avui dia, diversos equips d'extracció automatitzats poden substituir molts protocols manuals, però mai no s'ha aconseguit la recuperació i/o la purificació del 100% dels objectius.Els inhibidors potencials encara poden estar presents en els àcids nucleics purificats o ja han tingut efecte.Existeixen diferents estratègies per reduir l'impacte dels inhibidors.L'elecció de la polimerasa adequada pot tenir un impacte significatiu en l'activitat inhibidora.Altres mètodes provats per reduir la inhibició de la PCR són augmentar la concentració de polimerasa o aplicar additius com el BSA.
La inhibició de les reaccions de PCR es pot demostrar mitjançant l'ús del control de qualitat del procés intern (IPC).
S'ha de tenir cura d'eliminar tots els reactius i altres solucions del kit d'extracció, com ara etanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol i fenol, de l'aïllat d'àcid nucleic mitjançant un pas de rentat minuciós.Depenent de la seva concentració, poden activar o inhibir la PCR.